Oyun, Chell'in içinde sadece bir yatak, bir tuvalet ve bir radyo bulunan küçük bir cam odada uyanmasıyla başlar. GLaDOS tarafından kendisine testlerin yakında başlayacağı söylenir ve duvarlardan birinde turuncu bir portal açılır. Oyuncu geçitten geçtikten sonra test odalarına girer ve teste başlar. Test Odaları adı verilen toplam 20 test odası vardır.
Testler basit bir şekilde başlar. Chell'in Ağırlıklı Depolama Küpleri (kısaca Küpler) adı verilen kutuları alması ve bunları odanın çıkış kapısını açacak düğmelere yerleştirmesi gerekiyor. Bu noktada GLaDOS, Chell ile bir rehber olarak konuşur, onu över ve testler bittiğinde ona pasta sözü verir. Oyunun başlangıcına yakın bir zamanda Chell, Portal Tabancası olarak da bilinen Aperture Science El Portal Cihazını alır. İlk başta, Portal Tabancası sadece mavi portallar yapar ve turuncu portallar GLaDOS tarafından yapılır. Daha sonra, Chell tam Portal Silahını alır ve hem mavi hem de turuncu portallar yapabilir.
Oyunun ilerleyen bölümlerinde testler giderek daha tehlikeli hale geliyor. Bazı odalarda yerde zehir var. Diğerlerinde ise Yüksek Enerji Peletleri adı verilen ve dokunması halinde Chell'i öldürecek olan elektrik topları var. Bu testler sırasında, GLaDOS giderek daha alaycı hale gelir ve Chell'e "Buradaki zemin seni öldürecek" gibi işe yaramaz tavsiyeler verir. Ondan kaçınmaya çalış." Bir noktada GLaDOS, Chell'e bir odanın bozuk olduğunu ve onun yerine Taret adı verilen nöbetçi silahlarla dolu bir odadan geçmesi gerektiğini söyler. Eğer bir Taret Chell'i görürse, Chell ölene kadar ona ateş edecektir. Bu odada gizli bir oda vardır. Gizli odada duvarlarda bilinmeyen bir kişi tarafından bırakılmış çizimler ve yazılar vardır. Yazıda "pasta bir yalan" ve "o her zaman izliyor" gibi şeyler yazıyor ve bir kamera resmi var. Daha sonraki odalarda buna benzer başka odalar da vardır.
Başka bir odada Chell, testi çözmek için üzerinde kalpler olan Ağırlıklı Depolama Küpüne benzeyen Ağırlıklı Yoldaş Küpünü kullanmak zorundadır. Test sırasında GLaDOS Chell'e birkaç kez Yoldaş Küp'ün canlı olmadığını söyler, ancak testin sonunda Chell'e bir sonraki teste geçmek için Yoldaş Küp'ü "öldürmesi" gerektiğini söyler.
Son test sırasında Chell'in hareketli bir platformun üzerinde durması gerekiyor. Platformun yolunun sonunda, platform onu bir ateş çukuruna taşıyacaktır. GLaDOS testleri yaptığı için Chell'e teşekkür eder. Son dakikada, Chell tuzaktan kaçmak için Portal Silahını kullanır. Binadan kaçmaya çalışırken, Chell GLaDOS'u bulduğu bir odaya yönlendirilir. Chell, GLaDOS'tan düşen beyaz bir topu kırar. GLaDOS ona onu kırmakla aptallık ettiğini çünkü ne olduğunu bilmediklerini söyler, ancak GLaDOS bunun onun ahlak çekirdeği olduğunu hemen anlar. Chell'e, Aperture Science için çalışan insanların onu "Ölümcül Nöro-Toksin" ile onları öldürmeyi bırakması için yüklediğini söyler. Chell onu kırdığı için GLaDOS Nöro-Toksini tekrar kullanabilir. Chell'in, Nöro-Toksin Chell'i öldürmeden önce GLaDOS'u öldürmek için 6 dakikalık bir zaman sınırı vardır. Ondan parçalar koparıp yaktıktan sonra GLaDOS yok edilir ve Chell binadan kaçar.
Chell kaçtıktan sonra bayılır ve bir robot onu binaya geri sürükler. Jenerik sırasında GLaDOS, Jonathan Coulton tarafından yazılan ve Chell onu öldürmüş olsa da hâlâ hayatta olduğunu söyleyen "Still Alive" adlı bir şarkı söyler.
