Bir restriksiyon enzimi, DNA'yı belirli yerlerden kesen bir enzimdir. "Restriksiyon bölgeleri" olarak bilinen belirli tanıma nükleotid dizilerinde veya yakınında çalışır. DNA'yı kesmek için, tüm restriksiyon enzimleri DNA çift sarmalının her bir ipliği boyunca bir kez olmak üzere iki kesik açar.

Bu enzimler bakteri ve arkelerde bulunur ve onları bakteriyofaj olan istilacı virüslere karşı savunur.

Bir prokaryotun içinde, restriksiyon enzimleri yabancı DNA'yı restriksiyon adı verilen bir işlemle seçici olarak keser. Konak DNA, konak DNA'yı koruyan ve bölünmeyi engelleyen başka bir enzim tarafından korunur. Bu iki süreç birlikte restriksiyon modifikasyon sistemini oluşturur. En eski ve en basit bağışıklık sistemidir. Ayrıca bir tür bencil, hareketli genetik unsurdur.

3000'den fazla restriksiyon enzimi ayrıntılı olarak incelenmiştir ve bunların 600'den fazlası ticari olarak mevcuttur. Bu enzimler laboratuvarlarda DNA modifikasyonu için rutin olarak kullanılmaktadır ve moleküler klonlamada hayati bir araçtır.