Yönlendirilmiş evrim

Yazar: Leandro Alegsa

18-05-2022

Yönlendirilmiş evrim (DE), endüstriyel veya tıbbi amaçlarla enzim üretmek için kullanılan bir yöntemdir.

Yöntem, doğal seçilimi taklit eden protein mühendisliğidir.

Temel fikir, bir geni tekrarlanan mutasyon turlarından geçirerek bir varyant kütüphanesi oluşturmaktır. Seçilim, istenen işleve sahip genleri izole eder. Bunlar bir sonraki tur için şablon oluşturur.

Bu, in vivo (canlı bakteri veya maya hücrelerinde) veya in vitro (çözeltide veya mikro damlacıklarda serbest) yapılabilir.

Daha fazla mutantın test edilmesi, istenen özelliklere sahip bir mutant bulma şansını artırır.

İn vivo evrim sırasında, her hücre (genellikle bakteri veya maya) varyant kütüphanesinin farklı bir üyesini içeren bir plazmid ile dönüştürülür. Hücreler arasında yalnızca ilgilenilen gen farklılık gösterir, diğer tüm genler aynı kalır.

Hücreler proteini ya sitoplazmalarında ya da işlevinin test edilebileceği yüzeylerinde ifade eder. Bu format, evrimleşmiş protein veya RNA canlı organizmalarda kullanılacağı zaman yararlı olan hücresel bir ortamdaki özellikleri seçme avantajına sahiptir.

Hücreler olmadan yapıldığında DE, çözelti içinde veya yapay mikro damlacıklar içinde serbest proteinler veya RNA üretmek için in vitro transkripsiyon çevirisini kullanır. Bu, daha fazla koşula (örneğin sıcaklık, çözücüler) izin verme avantajına sahiptir. Hücreler için toksik olabilecek proteinleri ifade edebilir. Ayrıca, in vitro evrim deneyleri çok daha büyük kütüphaneler oluşturabilir (10'a kadar¹⁵ ) çünkü kütüphane DNA'sının hücrelere yerleştirilmesi gerekmez. Bu genellikle yapılabilecekleri sınırlar.

Doğal evrim ile karşılaştırmalı bir yönlendirilmiş evrim örneği. İç döngü, parantez içinde taklit edilen doğal süreçle birlikte yönlendirilmiş evrim döngüsünün üç aşamasını göstermektedir. Dıştaki daire tipik bir deneydeki adımları göstermektedir. Kırmızı semboller işlevsel varyantları, soluk semboller ise azaltılmış işleve sahip varyantları göstermektedir

Kalıtımın sağlanması

İşlevsel proteinler izole edildiğinde, genlerinin de izole edilmesi gerekir, bu nedenle bir genotip-fenotip bağlantısı gereklidir.

Bu, mRNA geninin puromisin ile çeviri sonunda proteine bağlandığı kovalent olabilir.

Alternatif olarak protein ve geni bir arada veya emülsiyon damlacıkları içinde tutulabilir. İzole edilen gen dizileri daha sonra PCR veya dönüştürülmüş konakçı bakteriler tarafından çoğaltılır. En iyi tek sekans ya da sekans havuzu, bir sonraki mutajenez turu için şablon olarak kullanılabilir. Tekrarlanan çeşitlendirme-seçim-amplifikasyon döngüleri, enzim varyasyonlarının seçim sürecine adapte olmasını sağlar.

İfade edilen bir protein, genine kovalent olarak bağlanabilir (mRNA'da olduğu gibi), solda veya onunla aynı bölmeye konabilir, sağda. Her iki şekilde de proteini kodlayan gen izole edilir

Verilen ödül

ABD'li mühendis Frances Arnold, yönlendirilmiş evrime öncülük ettiği için Milenyum Teknoloji Ödülü'nü kazandı.

Sorular ve Yanıtlar

S: Yönlendirilmiş evrim nedir?

C: Yönlendirilmiş evrim (DE), endüstriyel veya tıbbi amaçlarla enzim üretmek için kullanılan bir yöntemdir. Doğal seçilimi taklit eden bir protein mühendisliği biçimidir.

S: Yönlendirilmiş evrim nasıl çalışır?

C: Yönlendirilmiş evrim, bir geni tekrarlanan mutasyon turlarından geçirerek bir varyant kütüphanesi oluşturarak çalışır. Seçilim daha sonra istenen işleve sahip genleri izole eder ve bunlar daha sonra bir sonraki tur için şablon olarak kullanılır.

S: Yönlendirilmiş evrim nerede yapılabilir?

C: Yönlendirilmiş evrim in vivo (canlı bakteri veya maya hücrelerinde) veya in vitro (çözeltide veya mikro damlacıklarda serbest) yapılabilir.

S: Yönlendirilmiş evrimi in vivo yapmanın avantajları nelerdir?

C: Yönlendirilmiş evrimi in vivo olarak yapmak, hücresel bir ortamda özellikler için seçme avantajına sahiptir; bu, evrimleşmiş protein veya RNA canlı organizmalarda kullanılacağı zaman yararlıdır.

S: Yönlendirilmiş evrimi in vitro yapmanın avantajları nelerdir?

C: İn vitro yönlendirilmiş evrim, daha fazla koşula (örneğin sıcaklık, çözücüler) izin verme avantajına sahiptir ve hücreler için toksik olabilecek proteinleri ifade edebilir. Ayrıca, DNA'nın hücrelere yerleştirilmesi gerekmediği için çok daha büyük kütüphaneler oluşturabilir.

S: Bir in vitro deney sırasında yapılabilecekleri sınırlayan nedir?

C: Bir in vitro deney sırasında yapılabileceklerin boyut sınırı genellikle hücrelere ne kadar DNA eklenmesi gerektiğine göre belirlenir.