Stuart, 25 Ekim 1861'de Avustralya'yı üçüncü kez geçme girişiminde bulunmak üzere yola çıktı. Bu sefere Büyük Kuzey Keşif Seferi adı verildi. Grup şöyleydi: John McDouall Stuart, William Darton Kekwick, Francis William Thring, William Patrick Auld, Stephen King Jnr., John William Billiatt, James Frew Jnr., Heath Nash, John Woodforde, John McGorrery ve Frederick George Waterhouse.
McGorrey, grubun 78 atının nallarını tamir edebilecek bir demirciydi. Waterhouse ise keşiflerinin bilimsel notlarını tutabilecek bir doğa bilimciydi. Stuart bir atın sağ elinin üzerine çıkması sonucu yaralandı ve iyileşmek için bir ay geride kaldı. Burke ve Wills'in Cooper Creek'teki ölümlerini öğrendi.
Grup 8 Ocak 1862'de Chambers Creek'ten ayrıldı ve günde 30 ila 50 kilometre yol kat ederek hızla ilerledi. Bu hızlı tempo nedeniyle ilk üç hafta içinde sekiz at ölmüş ve Woodforde atları bırakıp geri dönmüştür. Stuart erzakların bir kısmını geride bıraktı ve her adamın yemesine izin verilen miktarı azalttı. Orta Avustralya'daki Hay Dağı'nda yine Aborijin savaşçıların saldırısına uğradılar, ancak grubun silahlarına denk değillerdi ve birkaçı öldürülmüş olabilir.
Üç ay içinde Newcastle Waters'a ulaştılar ve sonra dinlenmek için bir hafta ayırdılar. Stuart sonraki beş haftayı su arayarak geçirdi. Sonunda bir dizi su birikintisi, dere ve nehir buldu ve bu da tüm grubun kuzeye doğru devam edebileceği anlamına geliyordu. Victoria Nehri'ne ulaşmaya çalışmaktan vazgeçti. Ludwig Leichhardt tarafından 1845 yılında keşfedilen Roper Nehri'ne vardıklarında, batıya Carpentaria Körfezi'ne kolayca gidebileceğini biliyordu ama bunun yerine kuzeye devam etmeyi seçti. Auld daha sonra şöyle demiştir: "...sivrisinekler ve sinekler korkunçtu. Ellerimiz, ayaklarımız ve boyunlarımız onların ısırıklarıyla su topladı." Arnhem Land'ı geçtiler ve şimdiki Kakadu Ulusal Parkı'nın kenarından ilerlediler. Adelaide Nehri'ni takip etti, ancak zemin çok yumuşak ve çamurlu hale gelince, daha kuzeye Mary Nehri'ne gittiler ve sonunda denize ulaştılar.
Van Diemen Körfezi'ne 24 Temmuz 1862'de vardılar. Uzun bir ağaç dalına, Chamber'ın kızı Elizabeth tarafından yapılan ve üzerinde Stuart'ın adının yazılı olduğu Union Jack bayrağını diktiler. O zamandan beri tahrip edilmiş olan ağaçtan elde edilen odun, Güney Avustralya Kraliyet Coğrafya Derneği'nin koleksiyonunda bulunmaktadır. Grup daha sonra Adelaide'e geri dönmek için 3.400 km (2.113 mil) yol kat etmek zorunda kaldı. Yiyecek kıtlaşıyordu ve sıcak hava çok az su olduğu anlamına geliyordu. Birçok at öldü ve Stuart yine ekipmanlarını geride bırakmak zorunda kaldı. Waterhouse özenle topladığı tüm bitki ve hayvanları bırakmak zorunda kaldı. Adamlar çok açtı ve hatta dingoları vurup yediler. Stuart'ın sağlığı kötüydü ve kör olmuştu. Birkaç gün boyunca konuşamadı ve adamlar onun öleceğini düşündüler. Atına binemiyordu ve iki at arasında taşınabilen uzun sırıklar ve battaniyelerle bir yatak yaptılar. Stuart bu yöntemle 960 km (597 mil) taşındı. MacDonnell Sıradağları'nı geçtikten sonra yağmur yağdığını ve bol miktarda ot olduğunu keşfettiler. Yerleşim bölgelerine ulaştıklarında Stuart, arkadaşı ve ortağı James Chambers'ın öldüğünü öğrendi. Grubun sorumluluğunu Kekwick'e bıraktı ve Auld ile yola devam etti. Kapunda'da trene bindiler ve 17 Aralık 1862'de Adelaide'e vardılar.
Stuart ve grubu 16 Ocak 1863'te Adelaide'de özel bir şekilde karşılandı. Eski kıyafetlerini giydiler ve şehre kahramanlar gibi at sürdüler. Bu aynı zamanda Burke ve Wills'in başarısızlıkla sonuçlanan seferlerinin ardından Melbourne'de gömüldükleri gündü.