1606 yılında Smith, Virginia Şirketi tarafından kâr amacıyla Virginia Kolonisi'ne yerleşmek üzere işe alındı. Aralık 1606'da üç gemiyle yola çıktılar. Smith'in Samuel Collier adında bir hizmetkârı vardı. Samuel Collier yolun büyük kısmında onun yanında kaldı.
Yolculukta sorunlar yaşandı ve Smith isyanla suçlandı. Kaptan Newport onu idam etmeyi planladı. Kaptan, Virginia Şirketi'nden gelen ve Smith'in yeni koloninin liderlerinden biri olması gerektiğini belirten bir emir mektubunu açtı, bu nedenle Smith öldürülmedi.
İngilizler Nisan 1607'de geldi ve Kaptan Wingfield koloninin kurulacağı yer olarak Jamestown'ı seçti. Yaz aylarında yerleşimciler hâlâ geçici konutlarda yaşıyordu. Dört ay süren okyanus yolculuğundan sonra, yiyecek stokları her bir kişinin günde sadece bir ya da iki fincan tahıl unu yemesine yetecek kadardı. Hava koşulları ve gıda yetersizliği nedeniyle hastalık insanlara yayıldı ve Eylül ayına kadar yarısından fazlası öldü.
Aralık 1607'de Smith yiyecek arıyordu ve Amerikan yerlileri tarafından yakalandı. Powhatan kabilesinin şefiyle görüşmeye götürüldü. Köy Jamestown'dan yaklaşık 15 mil uzaktaydı. Smith zarar görmeden serbest bırakıldı ve kendisini bedeninin üzerine atan şefin kızı Pocahontas'a kısmen teşekkür etti. Bunu gören babası Smith'e merhamet etti ve Smith güvenli bir şekilde Jamestown'a geri götürüldü. Bu karşılaşma yerliler, Smith ve Jamestown'daki kolonistler arasında dostane bir ilişki başlattı. Ocak 1608'in başlarında, yaklaşık 100 yeni yerleşimci Kaptan Newport ile birlikte geldi ve dikkatsizlik sonucu köy ateşe verildi. O kış James Nehri dondu ve yerleşimciler harabelerde yaşamak zorunda kaldı. Bu süre zarfında Newport ve mürettebatı gemilerine demir pirit (aptal altını) yüklemek için çok zaman harcadı. Yiyecek stokları azaldı ve Amerikan yerlileri biraz yiyecek getirmiş olsa da Smith "yarımızdan fazlası öldü" diye yazdı.
Nisan 1608'de bir gemi erzak ve Smith'in konut inşa etmek ve ekin ekmek üzere yerleştirdiği 50 yeni yerleşimci getirdi.
1608 yazında Smith, Chesapeake Körfezi bölgesini keşfetmek ve şiddetle ihtiyaç duyulan yiyeceği aramak için Jamestown'dan ayrıldı. Yüzyılı aşkın bir süre boyunca Virginia kaşifleri için büyük değer taşıyacak bir harita yaptı. Smith yokluğunda yerine arkadaşı Matthew Scrivener'ı vali olarak bıraktı. Scrivener daha sonra Hog Adası'na yaptığı talihsiz bir yolculukta fırtınada boğulacaktı. Smith Eylül 1608'de yerel konseyin başkanı seçildi ve katı kurallar koydu.
Ekim 1608'de, aralarında ilk kadınların da bulunduğu 70 yeni yerleşimciyle birlikte bir gemi geldi. Bazı Alman ve Polonyalı zanaatkârlar da geldi, ancak yanlarında yiyecek malzemesi getirmediler. Bundan sonra Smith, Amerikan yerlilerinden yiyecek almaya çalıştı ve onların itaat etmesi için askeri güç tehdidi gerekti. Powhatan bölgeye gelen çok sayıda beyaz adamdan korkuyordu ve onları aç bırakmaya çalışıyordu.
Smith, hem yerleşimciler hem de Amerikan yerlileri arasında onun kurallarından hoşlanmayan ve onu öldürmeyi planlayanlar olduğunu fark etti. Smith, Pocahontas tarafından uyarıldığını yazdı. Bir toplantı düzenledi ve çalışmayan adamlara "çalışmayan yemek yemeyecek..." dedi. Ondan sonra durum düzeldi.
1609'un başlarında, Şubat, Mart ve Nisan aylarında üç ay boyunca Jamestown'da her şey yolundaydı; birçok konut inşa edildi, dönümlerce arazi temizlendi ve pek çok başka iş yapıldı. Nisan ayında ise fareler ve rutubet depolanmış tüm mısırları yok etti. Yiyeceğe çok ihtiyaçları vardı ve Smith büyük bir yerleşimci grubunu balık tutmaya, diğerlerini de nehrin aşağısındaki kabuklu deniz hayvanlarını toplamaya gönderdi. Yiyecekleri olmadan geri döndüler ve kendilerine sunulan yetersiz tayınları almaya yeterince istekliydiler. Bu durum Smith'i kızdırdı ve silahlarını ve aletlerini Kızılderililerin meyveleriyle takas etmelerini emretti ve herkesin çalışmasını yoksa kalenin güvenliğini terk etmek zorunda kalacaklarını söyledi. Bazıları kaleyi terk edip Kızılderili köylerine gitti ama Powhatan'ın halkı da Smith'in "çalışmayan yemez" yasasına uydu. Bu yasa neredeyse açlıktan ölecek hale gelip evlerine dönene kadar yürürlükte kaldı.
Bir süre sonra Samuel Argall'ın kaptanlığını yaptığı beklenmedik bir gemi geldi. Gemide Smith'in geri ödeme sözüyle satın aldığı yiyecek ve şarap vardı. Argall ayrıca Virginia Şirketi'nin Jamestown'a yeni bir vali olan Lord De la Warr ile birlikte daha fazla malzeme ve yerleşimci göndereceği haberini getirdi.
Mayıs 1609'da Virginia'ya yapılan bir yolculukta, Virginia Şirketi'nin haznedarı Sir Thomas Smith, aralarında kadın ve çocukların da bulunduğu yaklaşık 500 kolonistin gelmesini sağladı. Dokuz gemiden oluşan bir filo yola çıktı. Gemilerden biri limandan ayrıldıktan kısa bir süre sonra fırtınada battı. Sea Venture gemisi, amiral ve Stephen Hopkins ile birlikte Bermuda adalarında battı. Bir yıl sonra, Mayıs 1610'da, kendi yaptıkları küçük teknelerle Jamestown'a vardılar. Gates kısa süre sonra kolonideki herkese yetecek kadar yiyecek olmadığını gördü ve Jamestown'ı terk etmeye karar verdi. Tekneleri Jamestown bölgesinden ayrılırken, yeni vali Lord De la Warr'ı taşıyan ve Jamestown'a geri dönmelerini emreden bir gemiyle karşılaştılar.
Ağustos 1609'da John Smith 300'den fazla yeni yerleşimcinin geldiğini görünce oldukça şaşırdı. Londra yeni yerleşimcileri nasıl ve nerede yaşayacaklarına dair hiçbir planlama yapmadan gönderiyordu.
Kaptan John Smith kanosunda kazara meydana gelen barut patlaması sonucu ağır yaralandı. Smith Ekim 1609'da tedavi için İngiltere'ye yelken açtı. İki buçuk yılını Jamestown için elinden gelenin en iyisini yapmaya çalışarak geçirmişti. Virginia'ya bir daha dönmedi. Tarih onun Jamestown'ın ilk yıllarındaki büyük katkısını doğrulamıştır.
Koloniciler çeşitli hastalıklardan ölmeye devam edecek ve o kış 500 kişiden tahminen 150'si hayatta kalacaktı. Buna rağmen Virginia Şirketi Jamestown'ı ayakta tutmak için yerleşimcileri finanse etmeye ve taşımaya devam etti. Önümüzdeki beş yıl boyunca Vali Gates ve Sir Thomas Dale sıkı disiplini korumaya devam ederken, Sir Thomas Smith Londra'da Jamestown'a göndermek üzere yetenekli zanaatkârlar ve başka yerleşimciler bulmaya çalıştı.
