Gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi

Tarih

Gaz-sıvı kromatografisi üzerine ilk araştırma makaleleri 1950 yılında yayımlanmıştır. Kimyagerler, bileşiklerin kromatografın ucundan dışarı aktığını görmek için farklı dedektörler kullandılar. Dedektörlerin çoğu bileşikleri yok ediyordu, çünkü onları yakıyor ya da iyonize ediyorlardı. Bu dedektörler kimyagerlerin numunedeki her bir bileşiğin tam kimliğini tahmin etmesine neden oluyordu. 1950'lerde Roland Gohlke ve Fred McLafferty yeni bir kombine makine geliştirdi. Gaz kromatografisinde dedektör olarak bir kütle spektrometresi kullandılar. Bu ilk cihazlar büyük, kırılgan ve başlangıçta laboratuvar ortamlarıyla sınırlıydı.

Tasarım karmaşıktı. Kromatograftan dışarı akan farklı bileşikler arasındaki zaman aralığını kontrol etmek zordu. Dolayısıyla, kütle spektrometresinin bir bileşik üzerindeki çalışmasını, bir sonraki bileşik kromatograftan çıkmadan önce bitirmesi gerekiyordu. İlk modellerde, kütle spektrometresinden alınan ölçümler grafik kağıdına kaydediliyordu. Yüksek eğitimli kimyagerler, her bir bileşiği tanımlamak için piklerin modellerini inceledi. 1970'lerde kütle spektrometrelerine analogdan dijitale dönüştürücüler eklendi. Bu, bilgisayarların sonuçları saklamasına ve yorumlamasına olanak sağladı. Bilgisayarlar hızlandıkça ve küçüldükçe, GC-MS daha hızlı hale geldi ve laboratuvarlardan günlük hayata yayıldı. Günümüzde, bilgisayarlı GC-MS cihazları su, hava ve toprağın çevresel olarak izlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca tarımın düzenlenmesinde, gıda güvenliğinde ve ilaç keşfi ve üretiminde de kullanılmaktadır.

Küçük bilgisayarların geliştirilmesi, GC-MS makinelerinin basitleştirilmesine yardımcı olmuştur. Ayrıca bir numuneyi analiz etmek için gereken süreyi de büyük ölçüde azaltmıştır. Electronic Associates, Inc. (EAI), ABD'nin önde gelen analog bilgisayar tedarikçilerinden biriydi. EAI, 1964 yılında Robert E. Finnigan yönetiminde bilgisayar kontrollü bir kütle spektrometresi geliştirmeye başladı. 1966 yılına gelindiğinde 500'ün üzerinde gaz analiz cihazı satılmıştı. 1967 yılında Finnigan Instrument Corporation (FIC) kuruldu. 1968'in başlarında ilk prototip dört kutuplu GC-MS cihazlarını Stanford ve Purdue Üniversitelerine teslim etti. FIC daha sonra Finnigan Corporation olarak yeniden adlandırıldı ve GC-MS sistemlerinde dünya lideri olarak kendini kanıtlamaya devam etti.

Temel çalışma

GC-MS, bir örnek nesnede birbirine karışmış olan tüm bileşikleri bulabilir. Operatör numuneyi bir sıvı içinde çözer. Operatör daha sonra sıvıyı bir gaz akışına enjekte eder. (En sık Helyum, Hidrojen veya Azot gazı kullanılır.) Gaz, özel bir kaplaması olan bir tüpten akar. Numunedeki her bileşik kaplamaya farklı bir şekilde yapıştığından, her bileşik tüpten farklı bir zamanda çıkar. Böylece kaplama, numunede birbirine karışmış olan her bir bileşiği ayırmak için kullanılır. Her bir bileşik tüpün ucundan çıkarken iyonize olur ve bir elektrik yükü alır. Çoğu bileşik iyonize olduğunda parçalanır. Farklı parçalar, parçaları ağırlıklarına ve yüklerine göre ayıran bir mıknatısın altında uçar. Daha sonra bir bilgisayar her bir bileşiğin tüm parçalarını ölçer. Ölçümleri bilinen bileşiklerden oluşan bir bilgisayar kütüphanesi ile karşılaştıran bilgisayar, numunedeki tüm bileşiklerin isimlerinin bir listesini çıkarır. Bilgisayar ayrıca numunede her bir bileşikten ne kadar olduğunu da söyleyebilir.

Enstrümantasyon

GC-MS iki ana yapı taşından oluşur: gaz kromatografı ve kütle spektrometresi. Gaz kromatografı, kolonun boyutlarına (uzunluk, çap, film kalınlığı) ve faz özelliklerine (örneğin %5 fenil polisiloksan) bağlı olan bir kapiler kolon kullanır. Bir karışımdaki farklı moleküller arasındaki kimyasal özelliklerdeki fark, numune kolon boyunca ilerlerken molekülleri ayıracaktır. Moleküllerin gaz kromatografından çıkması (elute olması) farklı süreler (alıkonma süresi olarak adlandırılır) alır. Bu, aşağı akıştaki kütle spektrometresinin iyonize molekülleri ayrı ayrı yakalamasını, iyonize etmesini, hızlandırmasını, saptırmasını ve tespit etmesini sağlar. Kütle spektrometresi bunu her bir molekülü iyonize parçalara ayırarak ve bu parçaları kütle/yük oranlarını kullanarak tespit ederek yapar.

Bu iki makine birlikte kullanıldığında, ayrı ayrı kullanılan her iki üniteden çok daha hassas bir madde tanımlama olanağı sağlar. Tek başına gaz kromatografisi veya kütle spektrometresi ile belirli bir molekülün doğru bir şekilde tanımlanması mümkün değildir. Kütle spektrometresi işlemi normalde çok saf bir numune gerektirir. Geçmişte, gaz kromatografisinde Alev İyonizasyon Dedektörü gibi diğer dedektörler kullanılmaktaydı. Bu dedektörler, kolon boyunca ilerlemesi aynı süreyi alan farklı molekülleri ayıramaz. (İki farklı molekül aynı alıkonma süresine sahip olduğunda "birlikte çözündükleri" söylenir). Birlikte elute olan moleküller, her iki molekül için tek bir kütle spektrumu okuyan bilgisayar programlarını karıştıracaktır.

Bazen iki farklı molekül, kütle spektrometresinde (kütle spektrumu) benzer iyonize fragman modeline sahip olabilir. İki işlemin birleştirilmesi hata olasılığını azaltır. İki farklı molekülün hem gaz kromatografında hem de kütle spektrometresinde aynı şekilde davranması pek olası değildir. Bu nedenle, bir kütle spektrumu ilgilenilen analitle eşleşirse, bu spektrumun alıkonma süresi, analitin numunede olduğuna dair güveni artırmak için karakteristik bir GC alıkonma süresiyle kontrol edilebilir.

Kütle spektrometresi dedektör tipleri

Bir GC ile ilişkili en yaygın MS türü kuadrupol kütle spektrometresidir. Hewlett-Packard (şimdi Agilent) bunu "Kütle Seçici Dedektör" (MSD) ticari adı altında pazarlamaktadır. Nispeten yaygın bir diğer dedektör ise iyon tuzaklı kütle spektrometresidir. Ayrıca manyetik sektör kütle spektrometresi de bulunabilir. Ancak bu özel cihazlar pahalı ve hantaldır ve genellikle yüksek verimli hizmet laboratuvarlarında bulunmazlar. Uçuş zamanı (TOF), tandem kuadrupoller (MS-MS) (aşağıya bakınız) veya iyon kapanı MSⁿ gibi diğer dedektörler kullanılmaktadır. n, kütle spektrometrisi aşamalarının sayısını gösterir.

GC-MS'in iç kısmı, sağdaki fırında gaz kromatografının kolonu ile birlikte.


GC-MS şeması

Analiz

Bir kütle spektrometresi tipik olarak iki yoldan biriyle kullanılır: Tam Tarama veya Seçici İyon İzleme (SIM). Tipik bir GC-MS her iki şekilde de tek başına ya da her ikisi de aynı anda çalışabilir.

Tam tarama MS

Tam tarama modunda veri toplarken, hedef bir kütle parçası aralığı seçilir ve cihazın yöntemine yerleştirilir. İzlenecek tipik bir geniş kütle parçası aralığına örnek olarak m/z 50 ila m/z 400 verilebilir. Hangi aralığın kullanılacağının belirlenmesi, büyük ölçüde çözücü ve diğer olası girişimlerin farkında olunurken numunede ne beklendiğine göre belirlenir. Bir MS çok düşük m/z değerine sahip kütle parçalarını ararsa, havayı veya diğer olası girişim faktörlerini tespit edebilir. Geniş bir tarama aralığı kullanmak cihazın hassasiyetini azaltır. Makine saniyede daha az tarama yapacaktır çünkü her tarama daha geniş bir kütle parçası aralığını tespit etmek için daha fazla zaman alacaktır.

Tam tarama, bir numunedeki bilinmeyen bileşiklerin belirlenmesinde faydalıdır. Bir numunedeki bileşiklerin doğrulanması veya çözülmesi söz konusu olduğunda SIM'den daha fazla bilgi sağlar. Çoğu cihaz, "cihaz yöntemi" adı verilen bir bilgisayar programını çalıştıran bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Cihaz yöntemi GC'deki sıcaklığı, MS tarama hızını ve tespit edilen parça büyüklükleri aralığını kontrol eder. Bir kimyager bir cihaz metodu geliştirirken, test çözeltilerini GS-MS'ye tam tarama modunda gönderir. Bu, bir SIM cihaz metoduna geçmeden önce GC alıkonma süresini ve kütle fragman parmak izini kontrol eder. Patlayıcı dedektörleri gibi özel GC-MS cihazlarına fabrikada önceden yüklenmiş bir cihaz yöntemi vardır.

Seçilmiş iyon izleme

Seçilmiş iyon izlemede (SIM), cihaz yöntemi belirli iyon parçalarına odaklanır. Kütle spektrometresi tarafından yalnızca bu kütle parçaları tespit edilir. SIM'in avantajları, cihaz her tarama sırasında yalnızca az sayıda parçaya (örneğin üç parça) baktığından tespit limitinin daha düşük olmasıdır. Her saniye daha fazla tarama gerçekleştirilebilir. İlgilenilen sadece birkaç kütle parçası izlendiğinden, matris girişimleri tipik olarak daha düşüktür. Pozitif bir sonucu doğru okuma şansını artırmak için, çeşitli kütle parçalarının iyon oranları bilinen bir referans standardıyla karşılaştırılabilir.

İyonizasyon türleri

Moleküller kolon boyunca ilerledikten, transfer hattından geçtikten ve kütle spektrometresine girdikten sonra çeşitli yöntemlerle iyonize edilirler. Tipik olarak herhangi bir zamanda sadece bir iyonizasyon yöntemi kullanılır. Numune parçalandıktan sonra genellikle bir elektron çarpan diyot tarafından tespit edilir. Diyot, iyonize kütle parçasını daha sonra algılanan bir elektrik sinyali gibi ele alır.

Kimyagerler, Tam Tarama veya SIM izleme seçiminden ayrı olarak bir iyonizasyon tekniği seçerler.

Elektron iyonizasyonu

En yaygın iyonizasyon türü elektron iyonizasyonudur (EI). Moleküller MS'ye girer (kaynak bir kuadrupol veya iyon tuzaklı MS'de iyon tuzağının kendisidir) ve burada bir filamentten yayılan serbest elektronlarla çarpılırlar. Bu, standart bir akkor ampulde bulunan filamana benzer. Elektronlar moleküllere çarparak molekülün tekrarlanabilen karakteristik bir şekilde parçalanmasına neden olur. Bu "sert iyonizasyon" tekniği, düşük kütle/yük oranına (m/z) sahip daha fazla parçanın oluşmasıyla sonuçlanır. EI, orijinal molekülün kütlesine yakın bir kütleye sahip çok az sayıda parçaya sahiptir. Kimyacılar sert iyonizasyonun örnek moleküllere elektron fırlatmak olduğunu düşünmektedir. Buna karşılık, "yumuşak iyonizasyon", örnek molekülüne verilen bir gazla vurarak üzerine bir yük yerleştirmektir. Moleküler parçalanma modeli, sisteme uygulanan elektron enerjisine bağlıdır, tipik olarak 70 eV (elektron Volt). 70 eV kullanımı, test numunesinden üretilen spektrumların bilinen kütüphane spektrumlarıyla karşılaştırılmasına yardımcı olur. (Kütüphane spektrumları üretici tarafından sağlanan yazılımdan veya Ulusal Standartlar Enstitüsü (NIST-ABD) tarafından geliştirilen yazılımdan gelebilir). Yazılım, Olasılık Tabanlı Eşleştirme veya nokta-çarpım eşleştirme gibi bir eşleştirme algoritması kullanarak kütüphane spektrumlarını arar. Birçok yöntem standardizasyon ajansı artık tarafsızlıklarını sağlamak için bu algoritmaları ve yöntemleri kontrol etmektedir.

Kimyasal iyonizasyon

Kimyasal iyonizasyonda (CI), kütle spektrometresine tipik olarak metan veya amonyak gibi bir reaktif gaz konur. İki tür CI vardır: pozitif CI veya negatif CI. Her iki durumda da, reaktif gaz elektronlar ve analit ile etkileşime girecek ve ilgili molekülün 'yumuşak' iyonlaşmasına neden olacaktır. Daha yumuşak bir iyonizasyon, molekülü EI'nin sert iyonizasyonundan daha düşük bir dereceye kadar parçalar. Kimyagerler EI yerine CI'yi tercih ederler. Bunun nedeni, CI'nin ilgili analitin moleküler ağırlığıyla neredeyse aynı ağırlığa sahip en az bir kütle parçası üretmesidir.

Pozitif Kimyasal İyonizasyon

Pozitif Kimyasal İyonizasyonda (PCI) reaktif gazı hedef molekülle, çoğunlukla bir proton değişimi ile etkileşime girer. Bu, iyon türlerini nispeten yüksek miktarlarda üretir.

Negatif Kimyasal İyonizasyon

Negatif Kimyasal İyonizasyonda (NCI) reaktif gaz, serbest elektronların hedef analit üzerindeki etkisini azaltır. Bu azalmış enerji tipik olarak parçayı büyük bir tedarik içinde bırakır. (Parçalar daha fazla parçalanmaz.)

Yorumlama

Cihaz analizinin birincil amacı bir madde miktarını ölçmektir. Bu, oluşturulan kütle spektrumundaki atomik kütleler arasındaki bağıl konsantrasyonların karşılaştırılmasıyla yapılır. Karşılaştırmalı ve orijinal olmak üzere iki tür analiz mümkündür. Karşılaştırmalı analiz temel olarak verilen spektrumu bir spektrum kütüphanesi ile karşılaştırarak özelliklerinin kütüphanedeki bilinen bir örnek için mevcut olup olmadığını görür. Bu en iyi bilgisayar tarafından gerçekleştirilir çünkü ölçekteki farklılıklar nedeniyle birçok görsel bozulma meydana gelebilir. Bilgisayarlar ayrıca belirli verileri daha doğru bir şekilde ilişkilendirmek için daha fazla veriyi (GC tarafından tanımlanan alıkonma süreleri gibi) ilişkilendirebilir.

Bir başka analiz yöntemi de tepe noktalarını birbirleriyle ilişkili olarak ölçer. Bu yöntemde en yüksek tepe noktası %100 olarak belirlenir. Diğer piklere, pik yüksekliğinin en yüksek pik yüksekliğine oranına eşit bir değer verilir. 3'ün üzerindeki tüm değerler atanır. Bilinmeyen bileşiğin toplam kütlesi normalde ana pik tarafından gösterilir. Bu ana pikin değeri, bileşikte bulunduğuna inanılan çeşitli elementleri içeren bir kimyasal formüle uydurmak için kullanılabilir. Spektrumdaki izotop deseni, birçok izotopa sahip elementler için benzersizdir. Dolayısıyla, mevcut çeşitli elementleri tanımlamak için de kullanılabilir. Bu, bilinmeyen molekülün genel kimyasal formülünü gösterir. Bir molekülün yapısı ve bağları karakteristik şekillerde parçalandığından, pik kütlelerindeki farktan tanımlanabilirler. Tanımlanan molekül yapısı, GC-MS tarafından kaydedilen özelliklerle tutarlı olmalıdır. Tipik olarak, bu tanımlama cihazla birlikte gelen bilgisayar programları tarafından otomatik olarak yapılır. Bu programlar spektrumları, numunede bulunabilecek aynı element listesine sahip bilinen bileşiklerden oluşan bir kütüphane ile eşleştirir.

"Tam spektrum" analizi, bir spektrum içindeki tüm "tepe noktalarını" dikkate alır. Ancak, seçici iyon izleme (SIM) yalnızca belirli bir maddeyle ilişkili seçilmiş pikleri izler. Kimyagerler, belirli bir alıkoyma süresinde, bir dizi iyonun belirli bir bileşiğin karakteristiği olduğunu varsayarlar. SIM hızlı ve verimli bir analizdir. SIM, analistin bir numune hakkında önceden bilgi sahibi olduğu veya yalnızca birkaç spesifik madde aradığı durumlarda en iyi sonucu verir. Belirli bir gaz kromatografik pikteki iyonlar hakkında toplanan bilgi miktarı azaldığında, analizin hassasiyeti artar. Dolayısıyla, SIM analizi bir bileşiğin daha küçük bir miktarının tespit edilmesine ve ölçülmesine olanak sağlar. Ancak bu bileşiğin kimliği hakkındaki kesinlik derecesi azalır.

GC-tandem MS

Kütle parçalanmasının ikinci bir aşaması eklendiğinde, örneğin bir kuadrupol cihazında ikinci bir kuadrupol kullanıldığında, buna tandem MS (MS/MS) denir. MS/MS, ilgilenilmeyen arka plan bileşiklerinden oluşan bir matrikse sahip bir numunedeki düşük seviyedeki hedef bileşikleri ölçmede iyidir.

İlk kuadrupol (Q1) bir çarpışma hücresi (q2) ve başka bir kuadrupol (Q3) ile bağlantılıdır. Her iki kuadrupol de kullanılan MS/MS analizinin türüne bağlı olarak tarama veya statik modda kullanılabilir. Analiz türleri arasında ürün iyonu taraması, öncü iyon taraması, Seçilmiş Reaksiyon İzleme (SRM) ve Nötr Kayıp Taraması yer alır. Örneğin: Q1 statik modda (SIM'de olduğu gibi sadece bir kütleye bakarak) ve Q3 tarama modunda olduğunda, ürün iyon spektrumu ("daughter spectrum" olarak da adlandırılır) elde edilir. Bu spektrumdan, seçilen öncü iyon için ürün iyonu olabilecek belirgin bir ürün iyonu seçilebilir. Bu çift "geçiş" olarak adlandırılır ve SRM için temel oluşturur. SRM son derece spesifiktir ve matris arka planını neredeyse tamamen ortadan kaldırır.

Uygulamalar

Çevresel izleme ve temizleme

Birçok kimyager, GC-MS'nin çevredeki organik kirleticileri izlemek için en iyi araç olduğuna inanmaktadır. GC-MS ekipmanlarının maliyeti çok düşmüştür. Aynı zamanda GC-MS'nin güvenilirliği de artmıştır. Her iki gelişme de çevresel çalışmalarda kullanımını artırmıştır. Bazı pestisitler ve herbisitler gibi bazı bileşikler GS-MS ile tanımlanamaz. Diğer ilgili bileşiklere çok benzerler. Ancak, birçok ana pestisit sınıfı da dahil olmak üzere çevresel numunelerin çoğu organik analizi için GC-MS çok hassas ve etkilidir.

Kriminal adli tıp

GC-MS, bir suçluyu bir suçla ilişkilendirmeye yardımcı olmak için bir insan vücudundan gelen parçacıkları analiz edebilir. Yasa, yangın enkazını analiz etmek için GC-MS kullanılmasını kabul etmektedir. Aslında, Amerikan Test Malzemeleri Derneği'nin (ASTM) yangın enkazı analizi için bir standardı vardır. Örnekler genellikle çok karmaşık matrisler içerdiğinden ve mahkemede kullanılan sonuçların son derece doğru olması gerektiğinden, GCMS/MS burada özellikle yararlıdır.

Kolluk kuvvetleri

GC-MS yasadışı narkotiklerin tespiti için kullanılır ve sonunda uyuşturucu koklayan köpeklerin yerini alabilir. Ayrıca adli toksikolojide de yaygın olarak kullanılmaktadır. Şüphelilerden, kurbanlardan veya bir cesetten alınan biyolojik örneklerde uyuşturucu ve/veya zehirlerin bulunmasına yardımcı olur.

Güvenlik

Patlayıcı tespit sistemleri, 11 Eylül 2001 terör saldırılarının ardından ABD'deki tüm havaalanlarının bir parçası haline gelmiştir. Bu sistemler, birçoğu GC-MS'ye dayanan bir dizi teknolojiyle çalışmaktadır. FAA tarafından bu sistemleri sağlamak üzere sertifikalandırılmış sadece üç üretici bulunmaktadır. Bunlardan ilki, GC-MS tabanlı bir patlayıcı dedektörü serisi olan EGIS'i üreten Thermo Detection'dır (eski adıyla Thermedics). İkincisi ise şu anda Smith's Detection Systems'a ait olan Barringer Technologies'dir. Üçüncüsü ise Ion Track Instruments (General Electric Infrastructure Security Systems'in bir parçası).

Gıda, içecek ve parfüm analizi

Yiyecek ve içecekler, bazıları hammaddelerde doğal olarak bulunan ve bazıları işleme sırasında oluşan çok sayıda aromatik bileşik içerir. GC-MS, esterler, yağ asitleri, alkoller, aldehitler, terpenler vb. içeren bu bileşiklerin analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, bozulma veya tağşişten kaynaklanan ve zararlı olabilecek kirleticileri tespit etmek ve ölçmek için de kullanılır. Kirleticiler genellikle devlet kurumları tarafından kontrol edilir, örneğin pestisitler.

Astrokimya

Birkaç GC-MS dünyayı terk etti. İkisi Viking programıyla Mars'a gitti. Venera 11 ve 12 ile Pioneer Venus, Venüs'ün atmosferini GC-MS ile analiz etti. Cassini-Huygens görevinin Huygens sondası Satürn'ün en büyük uydusu Titan'a bir GC-MS indirdi. 67P/Churyumov-Gerasimenko kuyruklu yıldızındaki materyal 2014 yılında Rosetta misyonu tarafından kiral bir GC-MS ile analiz edilecektir.

Tıp

GC-MS yenidoğan tarama testlerinde kullanılmaktadır. Bu testler düzinelerce doğuştan metabolik hastalığı (Doğuştan metabolizma hatası olarak da bilinir) bulabilir. GC-MS idrardaki çok küçük miktarlardaki bileşikleri bile belirleyebilir. Bu bileşikler normalde mevcut değildir, ancak metabolik bozukluklardan muzdarip bireylerde ortaya çıkar. Bu, daha erken teşhis ve tedaviye başlamak için IEM'yi teşhis etmenin yaygın bir yolu haline gelmektedir. Bu da nihayetinde daha iyi bir sonuca yol açmaktadır. Artık bir yenidoğanı doğumda GC-MS'ye dayalı bir idrar testi ile 100'den fazla genetik metabolik bozukluk açısından test etmek mümkündür.

Metabolik bileşiklerin izotopik etiketlenmesi ile birlikte GC-MS, metabolik aktiviteyi belirlemek için kullanılır. Çoğu uygulama etiketleme olarak¹³ C kullanımına ve bir izotop oranı kütle spektrometresi (IRMS) ile¹³ C-¹² C oranlarının ölçümüne dayanmaktadır. IRMS, birkaç seçilmiş iyonu ölçmek ve değerleri oran olarak döndürmek için tasarlanmış bir dedektöre sahip bir kütle spektrometresidir.